以2mg抗体为例进行标记(抗生素抗性标记)(抗生素标记法)

发布日期：

2019-07-19 09:42:59丨

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抗体可以通过不同的化学物质与酶辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、荧光染料、生物素胶体金等交联。抗体标记HRP的最经典方法是NaIO4氧化法。首先，HRP糖基被氧化成醛基，醛基与抗体的-NH2反应形成席夫碱反应，抗体分子和HRP分子形成稳定的结构。在标记过程中，抗体分子与HRP分子的摩尔比为1:4，两个分子的质量约为1:1。

1.抗体/蛋白质的HRP标记

以2mg抗体为例进行标记。

1.1抗体/蛋白质治疗

将标记的抗体/蛋白质在50mM碳酸盐缓冲液0.015m Na2CO3，0.035m NaHCO3，pH9.6中透析，在此期间更换两次溶液，并将抗体/蛋白质浓度调整至2mg/ml。或者，用0.5M碳酸盐缓冲液0.15M Na2CO3，0.35M NaHCO3，pH9.6将高浓度抗体稀释至2mg/ml。如果原始抗体/蛋白质溶液含有TrisNH4+和其他无氨基试剂，则必须通过透析去除。

1.2 HRP酶氧化

1.2.1将2mg HRP干粉溶解在100μl ddH2O中。

1.2.2称取21mg NaIO4，溶于1ml ddH2O中，吸收100μL NaIO4溶液，缓慢与100μL HRP溶液混合，在4℃下静置30min，溶液变绿。

1.2.3吸收2μl乙二醇，缓慢加入氧化的HRP溶液，室温下在黑暗中静置30分钟，直到溶液变成棕色。

1.3抗体的标记

1.3.1将氧化的HRP溶液直接添加到经处理的抗体/蛋白质溶液中，并在室温下反应2小时。

1.3.2称取0.4mg NaBH4，溶解于20μl ddH2O中，所有ddH2O均加入上一步的反应溶液中，然后在4℃下静置2h，每30min振荡一次。

1.3.3在PBS中进行过夜透析。将体积比为30%-50%的甘油添加到标记溶液中，混合，并在-20℃下储存。

2.抗体/蛋白质的HRP标记